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特别综述

本文是印度肝胆科学研究所NirupmaTrehanpati等发表在HepatologyInternational(IF5，放心吧，咱们都是挑好的上菜)题为“ApplicationofCRISPR?Cas9basedgeneeditingtostudythepathogenesisofcolonandlivercancerusingorganoids”基因组编辑工具的发现和在定义的三维培养中培养干细胞/原始组织块是近10年来彻底改变生物学的两项突破性技术。在这方面，CRISPR?Cas9作为一种特殊的基因编辑工具的发现和来自成人干细胞的类器官培养为揭示器官发育过程和建立癌症模型提供了简便的工具。基因改造的类器官是通过连续的基因敲除和突变的驱动程序，基因组编辑和基于生态位的选择而发展起来的。在动物模型中异种移植的改良类器官忠实地再现了人类肿瘤的肿瘤事件。本综述集中在这两个强大的技术融合在一起，以了解结肠癌和肝癌的复杂性。

INTRODUCTION

创新新的生物工具是科学进步不可或缺的一部分。任何生物工具的成功都取决于它在多个研究领域的高精密度、重复性、易用性、成本效益和实用性。从其发现之日起，很少有技术能在很短的时间内产生重大影响，尤其是在转化医学健康领域。在这方面，CRISPR-Cas9基因组编辑工具，加上3D类器官技术，已经彻底改变了精确医学背后的科学。这些下一代技术极大地帮助理解了癌症等疾病进展的机制。

胃肠道癌的标志性特征包括已知致癌基因和肿瘤抑制基因的遗传和表观遗传改变[1]。异质性是胃肠道肿瘤的主要特征之一，了解其分子途径不仅对于了解胃肠道肿瘤的发病机制具有重要意义，而且对胃肠道肿瘤的预后也具有重要意义。为了研究致癌过程中的各个步骤，经常使用适当的动物和细胞培养模型。类器官作为三维细胞培养系统的出现，不仅有助于了解器官发育的组织结构，而且有助于建立人类疾病特别是癌症的模型。第一批人类和动物类器官来源于肠道上皮，后来这项技术被用来培养病人来源的类肿瘤细胞，这些类肿瘤细胞可以非常接近地概括肿瘤生物学[2,3]。利用质粒基因或慢病毒基因工程方法对基因过表达或击倒的正常类器官进行基因工程研究已取得成功。此外，当与基因组编辑工具一起使用时，类器官技术不仅可以模拟人类疾病，还可以为治疗性修正铺平道路。基本上有三种不同类型的基因组编辑viz，锌指核酸酶，转录激活因子样效应核酸酶(talens)和CRISPR/Cas9。这三种技术的效率和针对性各不相同。然而，CRISPR/Cas9的易用性使其成为基因工程类器官中最主要和最受欢迎的技术。事实上，基因组编辑的类器官非常接近人类癌症，并在后面的章节中描述(图1)。

TheCRISPR?Cas9system:fromabacterialadaptiveimmunesystemtoapowerfulgenomeeditingtoolCRISPR-CAS9系统：从细菌适应性免疫系统到强大的基因组编辑工具

CRISPR-Cas9最早发现于真细菌和花生中，是一种抵抗病毒感染的天然防御机制，有助于破坏入侵的噬菌体DNA/RNA。CRISPR-Cas9因此起到了分子剪刀的作用，这一发现已经被有效地用作基因组编辑的工具。首字母缩写CRISPR指的是24-40nt的簇状规则间隔短回文重复序列，在大肠杆菌和Haloferaxmediterranei中首次被认为是唯一的有序重复序列[4，5]。后来，在其他细菌和蜘蛛中也发现了类似的序列。伴随CRISPR位点的同源基因是编码CRISPR酶的Cas基因(对于CRISPR相关基因)。当人们注意到重复序列经常位于与噬菌体/前驱体紧密匹配的非细菌序列的两侧时，CRISPR-CAS相关位点的重要性就意识到了。从而表明这些外部序列是在细菌入侵期间捕获的，并作为记忆来防止未来的感染[6，7]。观察到携带与噬菌体相似的间隔区序列的细菌对携带相同序列的噬菌体的感染具有抵抗力，这导致了CRISPR-Cas系统类似于哺乳动物RNAi的假设[8，9]。随后在嗜热链球菌和大肠杆菌中的研究表明，CRISPR位点转录为成熟的CRISPRRNA(CrRNAs)。CrRNA的成熟依次由反式编码的小crRNA(TracrRNA)、内切酶Cas9和RNaseIII介导[10]。这种功能性的CRISPR-Cas9复合物可以切割互补的病毒序列，这取决于CRISPR-CAS系统的类型。此外，CRISPR-Cas系统还利用Protospacer相邻基序(PAM)，这些基序是Cas核酸酶有效和特异切割所需的特定小核苷酸序列。对病毒PAM序列的识别使CRISPR-Cas9有效地针对病毒核酸而不是宿主细菌基因组，从而成为一种有效的抗病毒防御系统。

目前已知的CaS基因约有93个，其中最有效的内切酶是切割DNA的Cas9。其他Cas蛋白，如Cas13，可以切割RNA[11]。另外，酶促死亡的Cas9(DCas9)可以修饰表观基因组，而不是切割DNA。虽然CRISPR-CAS系统是一种适应性原核生物免疫系统，但它在所需位点精确切割核酸序列的潜在能力已被用作基因敲除和敲除的有效基因组编辑工具[12]。细菌来源的CRISPR-CAS9系统作为一种强大的遗传工具的适应性，加上它的易用性，使其成为一项非常流行的技术，在生命科学中得到了广泛的应用，这是最近获得诺贝尔化学奖的当之无愧的技术[13]。CRSIPR-CAS9基因组编辑工具已被有效地用于理解使用下面概述的类器官模型研究癌症生物学。

Organoidtechnology:fromdevelopmentbiologytomodelingcancer类器官技术:从发育生物学到癌症模型

从二维单层细胞培养系统出发，可以在体外培养出类似器官的三维细胞已经是一项重大的成就。类器官是指在体外生长的自组织三维结构，起源于成体/多能干细胞。这项技术是由hansclever及其同事的实验室开发的。第一批成功的类器官是用含有g蛋白偶联受体5(lgr5)肠道成体干细胞的富亮氨酸重复建立的[14,15]。从那时起，几乎所有的人体器官都有类器官。类器官以多细胞结构生长，不仅模仿组织构造和病理，而且具有组织特异性功能。

类器官再生需要适当的生长因子和细胞外间质(3d)的存在。基本上类器官培养的建立有三个步骤:(a)启动，包括激活关键信号事件，使用特定的培养基和基质维持干细胞;(b)分化步骤，干细胞反过来产生不同的细胞谱系，从而诱导多细胞生物在生长因子和小分子的混合物存在下模拟组织结构;(c)最后利用自身免疫性扩增，以便在需要时堆积和繁殖[16]。相对于原代细胞培养因细胞衰老而停止复制，类器官可以扩增1年以上，这表明它们所来源的干细胞除了经历谱系命运的决定外，还可以自我更新。这种类器官技术最先使用肠道类器官和“迷你肠道”，因此得到的结果显示潘氏细胞、肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞的复合物。类脑技术现在已经适用于大多数器官。

除了从健康的组织中培养类器官外，类器官也可以从患病的组织中培养，这极大地帮助了解包括癌症在内的许多疾病的生物学。患者来源的类肿瘤显示类似的基因组改变作为主要的肿瘤牵连，他们确实忠实地概括了肿瘤生物学[2,3]。肿瘤细胞器中缺失的成分是基质细胞和免疫细胞区，然而，使用基于气液界面系统的新技术甚至可以模拟免疫肿瘤的微环境。类器官技术在理解胚胎发育和谱系规格的基础生物学方面有着巨大的希望。此外，来自正常组织的类器官和来自相应癌区的类肿瘤已成为研究疾病生物学的有用材料。利用这项技术，从结肠、胃、肝脏和胰腺中提取的胃肠道类器官已经被开发出来。本文综述了近年来在结肠和肝脏组织的类器官基因修饰方面的研究进展。

Coloncancerorganoids/tumoroidsandadvantages

类器官首次在结肠中由lgr5阳性干细胞发现[12,15]。与其他癌症不同，大肠癌，特别是遗传性非息肉大肠癌(hnpcc)通常与一些错配修复基因(如hmsh2、hmlh1等)的常染色体遗传有关。在这些患者中，结肠癌是主要的癌症风险，然而，这些患者也有患其他癌症的高风险，如胃癌、甲状腺癌等其他胃肠道癌症，对大肠癌患者的风险评估和分层至关重要。与甲醛固定组织相比，生成一个可再生的病人来源的结肠癌类器官库在预测生物学中将是极其重要的。此外，结肠直肠癌往往是异种的，许多药物有效的基于小鼠的癌症模型往往失败的临床试验重申人类癌症的遗传多样性。因此，在这种情况下，使用来源于患者的癌细胞器/肿瘤样细胞进行药物测试，以减少药物测试的周转时间，将为临床决策提供重要信息。最近的研究表明结肠肿瘤预测转移性疾病的效用。对以伊立替康为基础的姑息化疗无效的类肿瘤通常表现为转移性疾病[19]，从而预测疾病的进程。此外，正常结肠类器官的基因工程提供了疾病生物学上急需的信息，并在以后的章节中进行了描述。

CRIPSR/CAS9genomeeditinginhumancoloncancerorganoids

转基因类器官已经成为理解癌症生物学的有用工具。用质粒或慢病毒为基础的方法对正常类器官进行过表达或击倒基因的基因工程已经成功地进行。此外，当与Crispr-Cas9技术一起使用时，类器官技术不仅可以模拟人类疾病，而且为治疗性修正铺平了道路。年，施万克等人的一项研讨会工作[20]结合了类有机体和Crispr-Cas9两种强大的技术，用于纠正遗传缺陷用肠类器官模型制作囊性纤维化模型。将类器官与CRISPR-Cas9相结合的许多开创性工作都源于荷兰的汉斯·科克特博士团队[21]。

从癌基因或抑癌基因的有效敲除或敲除策略的应用角度来看，CRISPR-Cas系统的双重成分包括：(A)靶基因特异的CRISPRRNA(CrRNA)序列和反式激活的CRISPRRNA(TracrRNA)；(B)核酸内切酶，即Cas9。这共同构成了单个引导RNA(SgRNA)实体。特定的RNA序列引导RNA-蛋白质复合体进行相应的宿主DNA测序，核酸内切酶裂解产生双链断裂(DSB)。受损的哺乳动物DNA然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)修复，以产生插入和缺失。NHEJ途径在生成修饰类器官方面最有效，但是该方法容易出错。另一方面，HDR方法更具体，但效率较低。[22-24]。CRISPR-Cas9复合体的传递方式主要是基于染色体外质粒或病毒DNA传递系统。此外，CRISPR-Cas9的核糖核蛋白(RNP)递送也是首选的，因为它产生的脱靶效应较少。SgRNA的传递主要包括脂质体转染、电穿孔、慢病毒或外切体形式[21]。所有这些不同的方法都试图成功地修饰从正常上皮发育而来的类器官，以建立癌症特别是肠癌的模型。大肠癌一般分为四个亚型：(A)1型为微卫星不稳定性，伴有高甲基化，预后良好；(B)2型为Wnt信号激活，TP53基因突变；(C)3型为K-ras基因突变；(D)4型为转化生长因子β通路激活并间质浸润[25]。利用CRISPR/CAS9的基因组编辑技术，2、3和4型结直肠癌已经用类器官建模，并描述如下。

GeneticallymodifiedcolonorganoidsderivedbyCRIPSR/CAS9genomeeditingmimicsadenocarcinomaofcolon:singlevsdoublehitapproachCripsr/cas9基因组编辑模拟结肠腺癌:单敲与双敲除方法

关于Crispr/Cas9可以修饰正常类器官中的驱动基因从而模拟癌症发展的概念证明，首先是通过靶向肠道类器官模型中的腺瘤性息肉病基因(Apc)建立的。由于突变导致Apc失活，是结肠癌的典型特征。肿瘤抑制基因Apc与激酶Gsk3β和Ck1α/Ε(酪蛋白激酶1α/Ε)形成破坏复合物，有助于破坏Β-Catenin[26]。Apc是Wnt信号的负调节器。事实上，活跃分裂的肠隐窝细胞分泌Wnt，从而稳定Β连环蛋白及其核进入导致细胞生长。生长因子配体Wnt活化剂R-Spondin-1用于生长因子鸡尾酒中，作为Lgr5肠道干细胞的配体并诱导其增殖。如果在Lgr5细胞中Apc失活，Wnt通路将被激活，类细胞即使在没有R-Spondin的情况下也能生长，这确实被Schwank等人的经典实验[20]所证实。Crispr/Cas9使类器官的肠Lgr5细胞失活Apc基因，导致类结肠癌囊性形态的肠道类器官突变。此外，这项工作还开创了Rnf43和Znrf3的双重淘汰，它们也是Wnt监管机构，如Apc。这为在类器官中同时进行多位点定位铺平了道路，使用序列单一转染方案，从正常或前体病变来源的类器官形成腺瘤(表1)。此外，遗传性非息肉病大肠癌(Hnpcc)的一个显著特征是遗传性错配修复(Mmr)基因突变，即Mlh1或Msh2基因，它会导致微卫星不稳定性。使用Crispr-Cas9分子剪刀选择性地删除人类结肠器官中的错配修复基因Mlh1，导致与错配修复缺陷性结肠直肠癌的突变负担完全匹配的基因突变累积[26]。

GenomeeditingofcolonorganoidsbyCRIPSR/CAS9:multiplehitapproachCripsr/cas9:多敲除法编辑结肠类器官基因组

结肠癌通常被认为是克隆性的，包括肿瘤抑制基因(如APC和p53)的缺失和癌基因(如K-ras、Smad4等)功能增强的一系列进行性遗传事件[1]。与现有的小鼠或细胞培养模型最多获得一个或两个基因突变不同，Dorst等人进行了一系列优雅的实验。所有使用CRISPR-Cas9模块的人都对四个重要基因(APC、p53、K-ras、Smad4)进行了基因组编辑，并将其与适当的类器官培养基结合使用，以选择突变的类器官[27]。简单地说，首先开发了APC基因敲除突变体类器官，它可以在没有R-spondin培养基的情况下进行选择，如上一节所解释的那样。在失活的APC背景下，进行基因组编辑以使p53失活，并在p53激活剂Nutlin-3存在的情况下选择细胞。只有那些p53失活的细胞才能在Nutlin的遗传毒性作用下存活下来。这是因为Nutlin是p53的激活剂，并诱导具有野生型p53的类器官的细胞毒作用。在APC/p53双基因中基因敲除背景，引入了一个激活的K-rasG12突变。这给了类器官在没有表皮生长因子的情况下生长的选择性优势。最后，在没有骨形态发生蛋白途径抑制剂Nogin的情况下，通过Smad4的失活突变和类器官的筛选，对转化生长因子β途径进行靶向。本工作优雅地产生了一个具有KRasG12D激活突变和APC/p53/Smad4失活的四重突变的肠道类器官(图2)。当移植到小鼠模型中时，四重突变的类器官表现出侵袭性和染色体的不稳定性，从而重现了在人类中观察到的结直肠癌。另一项工作使用了五重策略，利用人类正常和腺瘤衍生的有机化合物，针对多个基因，即APC、Smad4、TP53、K-ras和PIK3CA[28]。工程类器官可以很容易地生长在最小的生长因子培养基中，也可以在异种移植中形成肿瘤。然而，只有在染色体不稳定的肠腺瘤起源的器官中才能看到大转移，这表明五重驱动突变本身不足以驱动转移，需要额外的染色体畸变。这项研究支持先前存在的人类腺瘤作为进展为肿瘤的前驱病变的作用。

Genomeeditingofcolonorganoidsbychromosomalengineeringandgenefusion利用染色体工程和基因融合技术编辑结肠类器官基因组

结直肠癌本质上是异质性的，其中一种类型是锯齿状结直肠癌，它现在已经在BRAFVE突变有机物中建模，随后进行转化生长因子β治疗(图2)。一般说来，转化生长因子β治疗人腺瘤结肠息肉时，肿瘤腺瘤(TA)中的类器官会发生凋亡。然而，用CRISPR/CAS9修饰以激活BRafVE突变的腺瘤衍生器官类器官在转化生长因子β存在的情况下抵抗细胞死亡[29]。有趣的是，在转化生长因子β存在的情况下，突变的BRAF修饰的腺瘤表现出锯齿状结直肠癌肿瘤的特征，这与4型结直肠癌非常相似，预后很差。最近，传统的结肠锯齿状腺瘤(TSA)采用了一种新的CRISPR/Cas9染色体工程方法，利用人类肠道来源的类器官进行了工程[30]。传统的锯齿状腺瘤通常表现为R-Respondin基因与eIF3或PTPRK融合，BRAF与DLGB1基因罕见融合也可见[31-33]。为了开发R-Respondin融合，日本佐藤的研究小组开发了一种新的染色体工程方法[34]。这涉及到基因重建，CRISPR-Cas9靶向融合断裂点，通过染色体缺失将R-Respondin与EIF3E或PTPRK基因融合。在一种具有激活BRAF和突变体GREM1的修饰的肠道有机体内进行了R-Respondin融合。在这个突变的类器官背景下，R-Respondin促进肿瘤的形成，其病理与传统的锯齿状腺瘤相似，移植到异种小鼠模型中。此外，与前面描述的其他结肠癌类器官模型不同，基因融合类器官模型显示了在人类结直肠癌中常见的甲基化表型。

CRISPR/CAS9geneticscreenincoloncancerorganoids

虽然上述策略利用了顺序基因组编辑，但在最近的发展中，类器官受到基于CRISPR-Cas9的高通量筛选，以寻找在CRC进展中新的候选基因[35]。CRISPR/Cas9筛选采用慢病毒转染的方法，以APC/Kras突变背景的肠道器官中9-10个基因为靶点，通过慢病毒转染引导RNA池。转化后的类器官被移植到小鼠模型中，并监测肿瘤的形成。CRISPR/Cas9筛选发现了结直肠癌中新的肿瘤抑制基因，即Activins(ACVR1B，Acvr2a)和染色质重构体Arid2，而TP53被鉴定为与大肠癌转移相关的候选基因。

Geneticallymodifiedhepaticorganoidsmimickinglivercancer

与易于使用基因组编辑工具的肠道器官模型不同，肝脏类器官模型很难转染，这是一个真正的挑战。直到最近，才在肝脏类器官模型中实现了基因组编辑。Artegiani等人[36]开创了一种名为CRISPR-Cas9介导的同源非同源非依赖器官转基因(CRISPR-HOT)的新工具，它允许在带有报告标签的类器官中插入基因(Knokkin)，以便容易地观察细胞并追踪它们的分裂。CRISPR-HOT利用NHEJ进行基因组整合。这项技术被尝试在肝脏类器官中敲钙粘蛋白基因和β-微管蛋白基因，分别标记肝细胞膜和有丝分裂纺锤体，以监测肝细胞分裂。最近的证据表明倍性状态增加是肝细胞癌的一个特征[37]。结合CRISPR-热敲除模型和p53基因敲除的肝脏类器官，作者发现有丝分裂纺锤体形成异常，非整倍体和多倍体增加。这项工作表明，损失P53的表达与有丝分裂纺锤体畸变有关，而有丝分裂纺锤体畸变可促进肝癌的发生。

Geneticallymodifiedorganoidsfrombiliarytractcancer(cholangiocarcinoma,gallbladder,andpancreas)胆道癌(胆管癌、胆囊癌和胰腺癌)中的转基因类器官

胆道器官，如胆管、胆囊和胰腺，都已成功地用于培养病人来源的类器官。通过引入特异的致癌基因突变，正常的人类类器官已经转化为肿瘤样胆管癌，胰腺癌和胆囊癌。导管来源的胆管细胞器官样细胞因使用Crispr/Cas9载体缺失P53和Bap1基因而导致上皮极性丧失、细胞间粘附减少和运动增加，这与胆管癌增殖增加的影响相一致[38]。在另一份报告中，具有激活的KRas背景的肝脏类器官经过基因组编辑，使用Crispr-Cas9灭活肿瘤抑制因子Pten和P53[39]。当这些修饰过的肝脏器官移植到小鼠模型上时，它们会产生类似于肝内胆管癌的肿瘤。

关于类器官来源于胆癌的报道很少。ErlanggaEtAl.[40]派生的鼠类胆囊器官表达突变体KRas或过度表达Erbb。这些类器官经过Crisprcas9基因编辑技术删除P53或Pten，然后移植到免疫缺陷的小鼠体内，就会产生类似于人类疾病的胆癌。

用正常胰腺组织进行序列基因组编辑，同时缺失肿瘤抑制基因，即Tp53、Cdkn2a和Smad4。当移植到免疫缺陷的小鼠体内时，由此产生的基因组编辑了类器官，导致了胰腺上皮内瘤变的发展[41]。

Neweradvancementsinorganoidsysteminpersonalizedmedicine

由于类器官是稳定和不断更新的，这一领域的一个主要进展是从病人的各种器官中提取类器官(PDO)。大规模生产的类脑器官/类肿瘤已被证明在捕捉和保存各种组织类型的癌症异质性方面是有用的。配对的正常和癌源性PDOS已被证明不仅对药物测试的高通量测试，而且对理解基因组改变非常有用。然而，使用类器官的一个局限性是缺乏免疫细胞和血管系统。肿瘤微环境由多种非实质细胞组成，如浸润性免疫细胞、内皮细胞、周细胞和肿瘤相关成纤维细胞。在这方面，最新的发展包括将类器官与肿瘤相关的成纤维细胞以及与患者来源的免疫细胞共培养以类似肿瘤。因此，胰腺导管腺癌已与癌相关的成纤维细胞共同培养，以模拟促纤维增生反应和炎症反应[42]。这些与患者T细胞共培养PDOS的新进展将在未来证明对预测免疫治疗的反应是有利的。有趣的是，一个报告显示，患者来源的类肿瘤可能含有浸润淋巴细胞，当用抗PD-1和/或抗PD-L1治疗时，导致类器官培养中的T细胞活化，并导致肿瘤细胞消除[43]。因此，目前的PDOS技术将使我们离精准医学更近一步。由于癌症通常涉及多种基因损伤，多靶点治疗需要有效的策略。由于表观基因组的改变是癌症的一个标志性特征，基于CRISPR的DCAS9表观基因组编辑是表观基因操纵的必要条件。虽然肠道类器官的基因组编辑研究已经得到了很好的研究，但是其他器官类器官的基因组编辑研究太少，因为它们很难转染。因此，需要基于下一代病毒载体、纳米粒子或外泌体的更好的传递系统。大多数CRISPR-CAS9载体使用同源DNA修复，其效率低于NHEJ，但基于NHEJ的重组方法通常容易出错。cRISPR/CAS9中最常见的挑战，就是错过目标效果和特定目标。为了了解癌症信号网络CRISPR/CAS9大型筛选策略类似的RNAI图库是必需的。

Prospects

来源于患者的类器官被证明在精准医学中作为药物测试和临床决策的工具非常有用。大多数描述癌症模型的研究都利用CRISPR/CAS9技术，通过引入正常类器官中的驱动因子突变来产生类肿瘤来模拟癌症。然而，几乎没有任何论文的驱动突变是灭活使用基因组剪刀编辑在肿瘤样本模型扭转正常的过程。类器官的基因组编辑和改良克隆的产生需要基于生态位的选择，并且总是有可能由于在连续培养条件下引入自发的外显子而使类器官对生长因子的退出产生抗性。虽然目前大部分基因组编辑使用类器官限制在体外设置，更大的挑战将是遗传类器官作为有效的工具，在体内治疗实体癌症的设置。编辑过的具有逆转癌症表型的类肿瘤能否用于精准医学仍然是一个期待已久的问题？基因组编辑为癌症的免疫疗法，带来了巨大的希望。在最近的一项研究中，LU等人，[44]使用CRISPR/CAS9对T细胞消融PD1，并将自体细胞回输给肺癌患者。这项研究报告了最小的非靶向效应，一个病人在治疗后表现出稳定的疾病，因为编辑过的T细胞被保留到72周。更多的研究需要利用新技术的类器官和基因组编辑的临床应用。尽管目前存在一些局限性，但将这两种强大的技术结合起来，使我们更接近精准医学的现实。

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