10./j.cell..02.
StanleyL.Hazen
摘要：一种微生物产生的代谢物，PAGIn，与心血管疾病和人类死亡有关。动物模型研究提供了对PAGIn代谢及其通过肾上腺素能受体驱动血小板侵袭和血栓形成的影响的见解。
介绍：心血管疾病(CVD)仍然是西方国家死亡和发病的主要原因，需要新的治疗靶点促进心血管疾病的发展和进展。假设研究对象与2型糖尿病(T2DM)病人体内将被证明是卓有成效的识别新途径与心血管疾病有关,因为T2DM患者发生CVD及其主要不良后果(MACE，主要不良心脏事件=心肌梗死(MI)，中风，或死亡)的风险明显更高，预后和预后更差。此外，传统的心血管疾病风险因素不能充分解释T2DM患者中观察到的风险升高。有趣的是，T2DM患者的血糖控制程度并不能很好地反映心血管疾病的发生风险，许多抗糖尿病药物降低了血糖水平，但并没有显著影响心血管疾病的发展或MACE风险。这些观察结果表明，与葡萄糖相关途径不同的代谢紊乱在2型糖尿病中发生，从而增加了该疾病中观察到的心血管疾病风险。
非靶向代谢组学正在成为发现与疾病相关通路的强大平台。这种相对公正的方法可以开发与给定表型相关的循环可电离分析物的全面列表，其化学结构可以列举。然而，对检测到的化学特征进行结构识别是具有挑战性的，而且在等离子体中观察到的光谱特征的很大一部分仍然是未知结构。在此，对T2DM受试者的血浆进行非靶向代谢组学分析，并结合机制研究，旨在揭示一种在2型糖尿病和非糖尿病患者中通过代谢途径形成的代谢产物，该代谢产物在2型糖尿病和非糖尿病患者中均增强，并与心血管疾病风险增高相关。必需氨基酸苯丙氨酸(Phe)是肠道微生物生成代谢物苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)的营养前体，PAGln在临床上和机械上都与CVD有关，并被证明通过宿主GPCRs促进CVD相关表型，包括a2A、a2B和b2-肾上腺素能受体(ADRs)。
结果：
非靶向代谢组学鉴定PAGln与CVD相关
A.在进行择期诊断性心脏评估的受试者中，化合物m/z.的相对血浆水平。受试者(n=)在3年随访中根据他们是否患有糖尿病或经历重大心脏不良事件(MACE)被分组。未知化合物中，最优的MACE相关候选化合物(m/z.)满足所有三个筛选纳入标准，显示3年MACE事件风险比为2.69(P=95%)。
B.Kaplan-Meier估计和按分析物m/z.四分位数排序的MACE风险。
C.m/z.血浆分析物通过多种表征明确指认为PAGln
D.Kaplan-Meier生存分析显示，PAGln水平高的受试者发生MACE事件(3年)的风险更大
E.而且，在调整传统的心脏危险因素后，较高的PAGln水平仍然是发生MACE风险的独立预测因子
体内肠道微生物参与PAGln和苯乙酰甘氨酸的生产
(A)受试者空腹血浆中PAGln水平:(1)口服低吸收广谱抗生素鸡尾酒治疗前(pre-Abx)，(2)抗生素治疗后7天(Abx)，(3)停用抗生素后3周(post-Abx)。
(B)健康受试者(左)、常规饲养小鼠(中)和GF小鼠(右)的空腹血浆PAGln和PAGly水平。在人类中，PAGln的循环水平比PAGly高出一个数量级。相比之下，小鼠中的PAGly水平比PAGln高一个数量级。
(C)小鼠腹腔注射苯乙酸(50mg/kg)后血浆中PAGln和PAGly的连续水平。经腹腔注射的PAA被证明主要代谢为PAGly
(D)雄性小鼠和雌性小鼠血浆中PAGln水平(1)口服广谱抗生素鸡尾酒(pre-Abx)，(2)抗生素治疗5天后(Abx)，和(3)停用抗生素后一周(post-Abx)。通过比较常规饲养和无菌(GF)小鼠、口服鸡尾酒Abx小鼠和口服鸡尾酒Abx小鼠血清中PAGly水平，发现肠道微生物群是PAA形成PAGly的关键参与者
(E)人类和小鼠中生物产生PAGln和PAGly的示意图。在人类和小鼠中，PAGln和PAGly是通过肠道微生物将膳食中的Phe转化为PAA的代谢途径在体内产生的，此时宿主与Gln(在人类)或Gly(在啮齿动物)发生结合反应，分别产生PAGln和PAGly。
PAGln增强血小板刺激诱导的钙释放和对多种激动剂的反应
健康志愿者的全血(30分钟)暴露于生理相关的PAGln水平，在生理剪切流下观察到的胶原依赖性血小板粘附和扩散速率显著加快（fig.3ABC）。用PAGln与生理盐水对富含血小板的人血浆进行短暂预处理后发现，PAGln显著增强了刺激依赖性血小板聚集,且当使用每种血小板激动剂(ADP、TRAP6或胶原蛋白)的固定次最大水平时，在PAGln的生理浓度范围内，PAGln也剂量依赖性地增强PRP中的血小板聚集程度（fig.3D）。在用洗净的人血小板进行的研究中，PAGln也剂量依赖性地增强了次最大ADP刺激的p-选择素表达和糖蛋白a2b3(GPIIb/IIIa)激活，PAGln水平为10μM时显著增加了血小板激活表型（fig.3EF）。
(A)在全血中，人血小板在生理剪切条件下粘附于微流控芯片表面（±PAGln）。血小板(绿色)。
(B)从指定数量的受试者中记录全血粘附血小板积分光密度。
(C)终点粘附血小板IOD，沿通道长度在5个高功率场(每次治疗和每个受试者)。
(D)固定浓度的PAGln(mM，红色)与生理盐水(对照，蓝色)(左)或不同浓度的PAGln(右侧)ADP刺激的血小板聚集反应。
(E)ADP诱导的p-选择素表面表达的变化，在用指定浓度的PAGln预先孵育的洗净的人血小板中。
(F)ADP诱导的血小板GPIIb/IIIa激活，通过PAC-1抗体染色对经PAGln孵卵的洗净的人血小板进行评估。
在体内，PAGln加速血小板凝块形成并增强血栓形成潜力
利用三氯化铁诱导的颈动脉损伤模型，研究PAGln和PAGly对体内凝块形成的影响。在小鼠中，通过ip注射，PAGln或PAGly分别急性升高，对颈动脉损伤后血小板凝血率和颈动脉内血流停止时间进行量化。值得注意的是，与营养前体Phe或生理盐水处理的小鼠相比，PAGln和PAGly均诱导损伤的颈动脉内血小板血栓形成增加(Fig.4A)，并相应地减少了损伤后血液停止流动的时间(fig.4B)。
肠道微生物基因porA和fldH在体内调节宿主血栓形成潜能
如图4C所示，同时携带功能性porA和fldH基因的(ΔcutC)C.sporogenes只产生同位素标记的PPA而不是PAA,ΔcutC、ΔfldH突变体不再产生PPA但产生PAA(图4C)。相反，(ΔcutC,ΔporA)C.sporogenes突变体不再产生PAA，只形成PPA。然后，直接测试了肠道微生物PAA的产生对宿主体内血栓形成的影响，将GF小鼠定植于(ΔcutC)C.sporogenes或(ΔcutC,ΔfldH)C.sporogenes突变体。在微生物定植之后，使用三氯化铁诱导的颈动脉损伤模型进行体内血栓形成评估时，从回收的样本中测定血浆中PAGly水平。从宰杀时盲肠内容物中提取的DNA进行PCR检测，证实了C.sporogenes接种后的定殖作用。体外培养数据预测(图4C)，GF小鼠与(ΔcutC,ΔfldH)C.sporogenes定殖导致PAGly水平显著高于(ΔcutC)C.sporogenes定殖小鼠(图4D)。动脉损伤后，(ΔcutC,ΔfldH)C.sporogenes发生突变体小鼠的血栓生成率和损伤血管内血流停止时间均显著降低，产生更高水平的PAA，和PAGly(图4D)。
PAGln显示与细胞的饱和和特异性结合，表明特异性受体-配体结合相互作用
创新点及可借鉴之处
通过检测MEG01细胞中潜在结合配体(PAGlnvsNorepivsPhe)浓度的增加，发现了饱和和特异性的DMR剂量反应曲线，这是与PAGln和Norepi而非Phe的配体受体相互作用过程的典型特征(Figure5A)。
PAGln通过G蛋白偶联受体介导细胞事件
阳性对照采用Norepi作为GPCR结合配体，阴性对照采用胶原蛋白。通过使用所有三种调节因子(PTX、CTX和ym)或全局GPCR抑制剂sh-预处理细胞，MEG01细胞中PAGln诱导的DMR反应显著降低，这强烈暗示了GPCR参与了细胞的PAGln反应(Fig.5B，左)。
此外，使用PTX或CTX预处理细胞，而不使用ym，可以显著抑制PAGln诱导的DMR反应，提示Gαi/o和Gαs和Gαq亚基参与(Fig.5B，左)。此外，DMR对Norepi的反应检测显示，在使用每种已知的GPCR调节剂孵育时，DMR信号显著减少(Fig.5B，中间)。Norepi已知可以通过上述三个G蛋白亚基发出不同程度的信号。相比之下，使用胶原蛋白的DMR信号，在将细胞预处理到每一种已知的GPCR调节剂中仍然不受影响(Fig.5B，右)。PAGln在MEG01细胞(Fig.5C)和洗净的人血小板(Fig.5D)中诱导了cAMP的适度但显著的短暂增加。此外，用已知的GPCR调节器对每一个进行预处理表明，CTX或全局GPCR抑制剂SCH-抑制了PAGln引起的cAMP的产生，这表明PAGln暴露触发了气体介导的腺苷酸环化酶的激活(Fig.5C和5D)。总的来说，这些数据表明PAGln在多个细胞中通过GPCR(s)介导细胞反应，包括分离的人血小板。
肠道微生物依赖代谢物PAGln通过ADRs发挥作用
鉴于PAGln通过GPCR(s)介导细胞反应，下一步试图确定受体的身份。注意到，PAGln与已知与ADRs大家族结合的儿茶酚胺具有某种相似的结构(图5E)。
由于ADRs具有一个灵活的激动剂口袋，假设PAGln可能通过ADRs诱导细胞信号，