原文出处：SugimuraN,LiQ,ChuESH.Lactobacillusgallinarummodulatesthegutmicrobiotaandproducesanti-cancermetabolitestoprotectagainstcolorectaltumourigenesis.Gut.Dec22:gutjnl--.
研究背景
结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)是世界上第三大常见的恶性肿瘤，其发病因素有很多，包括基因改变、生活方式和环境因素等。在过去十年中，肠道菌群已被证明在结直肠癌的发生发展中起着关键作用。大多数乳酸杆菌归类为乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)。乳酸菌对疾病的有益作用已被广泛报道，临床前研究已经表明它可减轻与癌症进展相关的慢性炎症。作者通过鸟枪法宏基因组测序，发现出一种在结直肠癌患者粪便中显著减少的益生菌种鸡乳杆菌，这表明它可能抑制结直肠癌的发生。本文，作者发现鸡乳杆菌可以通过促进细胞凋亡来抑制小鼠模型、人结直肠癌来源的类器官和结直肠癌细胞系的生长。这种抑瘤作用归因于鸡乳杆菌产生的代谢物吲哚-3-乳酸(Indole-3-lacticacid,ILA)。
研究结论
结果一、鸡乳杆菌对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生具有保护作用
为了探究鸡乳杆菌对结直肠肿瘤发生的影响，作者首先使用雄性ApcMin/+小鼠模型，分别用鸡乳杆菌、大肠杆菌MG菌株、PBS给小鼠灌胃8周。（图1A）结肠镜检查发现，鸡乳杆菌组的结肠肿瘤体积在外观上小于大肠杆菌MG组或PBS组。（图1B）鸡乳杆菌可显著减少ApcMin/+小鼠结肠（图1C、D、E）和小肠（图1D、E、F）肿瘤的数量和体积。为了确定鸡乳杆菌对结直肠癌的保护作用是否具有性别特异性，作者在雌性ApcMin/+小鼠身上进行重复实验，L.casei得到的结果与雄性小鼠一致。（图1G-L）这些结果表明鸡乳杆菌对雄性和雌性ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的发生均有抑制作用。图1
结果二、鸡乳杆菌对AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠肠道肿瘤发生具有保护作用
为了验证鸡乳杆菌是否对结直肠肿瘤发生具有抑制作用，作者建立了结肠炎相关性大肠癌模型，6周龄C57BL/6小鼠腹腔注射AOM10mg/kg，然后给予2%DSS，连续1周。（图2A）鸡乳杆菌显著降低了AOM/DSS诱导的雄性结直肠癌小鼠的结直肠肿瘤数量（图2B）和体积（图2C）同样，在AOM/DSS诱导的雌性CRC小鼠中也观察到了同样的结果。（图2D-F）这些结果表明鸡乳杆菌抑制AOM/DSS诱导的雄性和雌性小鼠结直肠肿瘤的发生。图2
结果三、鸡乳杆菌对ApcMin/+小鼠肠道菌群具有调节作用
为了探究鸡乳杆菌对肠道菌群的影响，作者对灌胃鸡乳杆菌8周后的ApcMin/+小鼠粪便样本进行了16SrDNA基因测序。与PBS组相比，鸡乳杆菌组微生物丰度显著增加，而与大肠杆菌组相比差异不显著。（图3A）虽然鸡乳杆菌灌胃小鼠粪便样品的β多样性与其他两组相比有明显的变化趋势，但差异无统计学意义。（图3B）然而，鸡乳杆菌可提高某些特征良好的共生益生菌的丰度，包括拟杆菌门的瑞士乳杆菌、罗氏乳杆菌和OTU。（图3C）相反，鸡乳杆菌处理的小鼠体内某些具有致病潜力的菌属丰度降低，如Alistipes,Allobacullum,Dorea等。（图3C）以上结果表明，虽然鸡乳杆菌不能改变肠道菌群的总体组成，但它可以丰富益生菌的数量，并可能减少肠道病原体。图3
结果四、鸡乳杆菌上清液抑制结肠癌细胞的活性
为了体外验证鸡乳杆菌对肿瘤的抑制作用，作者以两个大肠癌细胞系(HCT和LoVo)和一个正常结肠上皮细胞系(Ncm)为对照，进行了体外功能分析。鸡乳杆菌培养上清液（LGCS）以剂量依赖的方式显著降低CRC细胞的存活率，但对正常结肠上皮细胞的存活率无明显影响。（图4A-C）在HCT和LoVo集落形成实验中也观察到相似的结果：与ECCS组或BHI组相比，LGCS组集落数显著减少。（图4D）这些结果表明了鸡乳杆菌分泌的分子能抑制结直肠癌细胞的活力和集落形成能力。图4
结果五、鸡乳杆菌上清液促进结直肠癌细胞凋亡
为了探究LGCS抑制结直肠癌细胞活力的机制，作者使用AnnexinV-PE和7-AAD染色流式细胞仪定量检测LGCS对细胞凋亡和细胞周期分布的影响。结果发现LGCS显著促进了结直肠癌细胞系HCT（图5A）和LoVo（图5B）的凋亡，而对正常结肠上皮细胞NCM无影响。（图5C）此外，LGCS的这种凋亡诱导特性在来自2名患者（74与）的大肠癌类器官中得到进一步验证（图5D、E）相比之下，LGCS对结直肠癌细胞周期分布无影响（图5F-H）。图5
结果六、鸡乳杆菌产生的抗肿瘤分子是分子量小于3kDa的非蛋白质分子
为了探究鸡乳杆菌产生的抗结直肠癌分子的特性，用3kDa过滤装置将细菌培养上清液分离为低分子量(LMW)(3kDa)和高分子量(HMW)(3kDa)组分。作者发现，只有经LGCSLMW组分处理的结直肠癌细胞存活率下降，而LGCSHMW组分对CRC细胞没有抑制作用。（图6A）同时，热灭活的LGCS(图6B)和蛋白酶K处理的LGCS(图6C)都保留了降低结直肠癌细胞存活率的能力。这些结果表明，鸡乳杆菌的抗结直肠癌特性可被分子量3kDa的非蛋白分子诱导。接下来作者进行非靶向LC-MS/MS来鉴定LGCS-LMW组分中的抗CRC代谢物。主成分分析(PCA)结果图显示LGCS组、ECCS组和BHI组的LMW组分之间有明显的差异，（图6D）差异丰度分析显示鸡乳杆菌产生的关键产物可能与抗结直肠癌作用有关。（图6E）为了验证鸡乳杆菌产生的LMW分子是否与体内的抗结直肠癌作用有关，作者利用不同处理的ApcMin/+小鼠的粪便样本，对肠道代谢组学进行了分析。主成分分析显示，每天给予鸡乳杆菌可导致肠道代谢物的整体成分发生显著变化。（图6F）作者发现，鸡乳杆菌灌胃后，小鼠体内L-色氨酸、棕榈酸、4-吡哆酸和γ-L-谷氨酰-L-谷氨酸等代谢物显著上调。（图6G）其中，L-色氨酸是鸡乳杆菌分泌最高的代谢产物。L-色氨酸通常由肠道微生物群转化为其下游代谢物。作者推测鸡乳杆菌产生的L-色氨酸及其下游代谢产物可能与鸡乳杆菌的抗结直肠癌作用有关。图6
结果七、鸡乳杆菌产生并分解L-色氨酸，释放吲哚-3-乳酸以预防结直肠癌发生发展
为了进一步证实鸡乳杆菌L-色氨酸的产生及其向下游代谢产物的转化，作者在鸡乳杆菌的后期静止阶段使用培养上清进行高通量靶向L-色氨酸代谢谱分析，以确保代谢产物的充分释放和代谢转化。L-色氨酸及其下游代谢物的PCA图显示LGCS、ECCS和BHI之间有明显的差异。（图7A）鸡乳杆菌处理的ApcMin/+小鼠的粪便样本也显示与大肠杆菌处理或PBS处理的小鼠有明显的差异。（图7B）差异丰度分析表明，与对数期培养上清液相比，固定相LGCS中的L-色氨酸减少，表明鸡乳杆菌能分解L-色氨酸。（图7C）作者还发现一种L-色氨酸的下游分解代谢产物ILA，在LGCS(图7C)和鸡乳杆菌感染的ApcMin/+小鼠的粪便样本中都高度富集。（图7D）随后作者进行了ILA在体外结直肠癌细胞生长和体内肿瘤发生的功能研究，当ILA浓度与LGCS相当时，大肠癌细胞(HCT和LOVO)的细胞活力显著降低。（图7E）与LGCS的作用一致，ILA处理的CRC细胞凋亡增加。（图7F）在体内实验中，给ApcMin/+小鼠灌胃ILA(20mg/kg)(图7G)可显著减少肿瘤数量(图7H)和肿瘤体积。（图7I）ILA处理的肿瘤组织中，TUNEL染色阳性的细胞数量增加，但在相邻的正常组织中没有增加（图7J）。这些结果表明，鸡乳杆菌可以产生L-色氨酸，同时将其转化为其下游的ILA和其他代谢物，ILA至少部分有助于鸡乳杆菌的抑制肿瘤作用。图7
研究结论
鸡乳杆菌可抑制肠道肿瘤发生，这种作用与调节肠道微生物组成和分泌的代谢物(包括ILA)以促进癌细胞凋亡有关，此研究对预防结直肠癌的发生发展具有重要意义。校对：张丹
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