我国是世界上鸡蛋的生产和消费大国，蛋品产业在国民经济中占有重要地位。尽管中国的禽蛋产业在不断发展，但蛋品行业仍然存在诸多问题，例如，产品形式还是以传统壳蛋为主，深加工程度低，导致我国蛋品产业附加值不高，经济效益低。近几年来，诸多研究成果表明功能蛋白及蛋白肽往往具有极其重要的生物活性，尤其是功能蛋白水解后得到的活性肽片段，对机体功能环境有重要作用。
蛋清蛋白作为优质的蛋白质来源，通过口服的方式进入人体，在胃和肠道中进行转化。有研究表明，胃和肠道中的蛋白酶、pH值等均会影响蛋白质在人体胃肠道中的吸收与释放。因此，吉林省营养与功能食品重点实验室，吉林大学食品科学与工程学院的马思彤、刘静波、刘博群*等人通过对比碱性蛋白酶酶解及体外模拟胃肠消化2种方式处理蛋清蛋白后水解物的抗氧化活性差异，明确蛋白质深加工对于蛋清肽抗氧化活性的影响，以期为蛋品深加工的方法和意义提供一定的实验依据。
1、蛋清肽2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）阳离子自由基清除能力的变化
如图1所示，未经处理的蛋清蛋白ABTS阳离子自由基清除能力很差，在经过碱性蛋白酶酶解或者体外模拟胃肠消化后的蛋清蛋白被分解为多肽或者氨基酸，活性基团得以暴露；因此，在同一质量浓度条件下，和未经处理的蛋清蛋白相比，处理后的蛋清肽ABTS阳离子自由基清除能力都得到提高，其中分子质量小于1kDa的蛋清肽抗氧化活性高于其他分子质量的组分，随着分子质量的增大，蛋清肽的抗氧化活性减弱。
2、蛋清肽氧自由基吸收能力的变化
图2表示蛋清肽在质量浓度为10μg/mL时的荧光衰退曲线，在对照组（PBS代替抗氧化剂）中，荧光衰减最快，实验组荧光衰减较对照组均放缓，说明蛋清肽都有抗氧化活性。其中，分子质量小于1kDa碱性蛋白酶酶解物抗氧化活性最强，同ABTS阳离子自由基清除能力的结果一致。Trolox属于VE的水溶性类似物，是一种常用的抗氧化剂和自由基清除剂，在这里被用作阳性对照，可以看出和Trolox相比，蛋清肽的抗氧化活性仍存在一定差距。
分别计算蛋清肽的ORAC，分子质量小于1kDa碱性蛋白酶酶解物的ORAC最高，为（0.±0.）μg/mL，其次是分子质量小于1kDa体外模拟胃肠消化产物（（0.34±0.05）μg/mL），分子质量1～3kDa的碱性蛋白酶酶解物和体外模拟胃肠消化产物的ORAC分别为（0.31±0.13）μg/mL和（0.21±0.11）μg/mL，未经处理的蛋清蛋白与3～10kDa体外模拟胃肠消化产物活性接近。
3、HepG2细胞氧化损伤模型的建立
由图3可知，随H2O2浓度的升高，HepG2细胞的相对存活率降低，即氧化损伤作用越强。当H2O2的终浓度为μmol/L时HepG2细胞的相对存活率为（49.96±0.04）%，不同H2O2浓度之间的细胞存活率均有显著差异（P＜0.05），因此选择μmol/L的H2O2建立HepG2细胞氧化损伤模型，用于后续实验。
4、蛋清肽对HepG2细胞氧化损伤的影响
如图4所示，在μmol/L的H2O2作用下，分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解物活性最高，几乎可以保护细胞免受氧化应激损伤，中质量浓度组及高质量浓度组和对照组相比无显著差异（P＞0.05），细胞相对存活率分别为（96.62±0.05）%和（.87±0.08）%。分子质量3～10kDa的体外模拟胃肠消化产物活性最弱，与损伤组相比各质量浓度均无显著差异（P＞0.05），这可能是由于该组分蛋清肽分子质量较大，难以被细胞吸收利用。其他组分蛋清肽和损伤组相比均有显著差异，说明不同组分蛋清肽均能不同程度上对细胞氧化损伤有保护作用，且碱性蛋白酶酶解物的活性优于体外模拟胃肠消化产物。
5、蛋清肽的细胞内ROS清除活性
如图5所示，H2O2处理后，HepG2细胞内DCF荧光强度显著增强（P＜0.05），大约是对照组的3倍，表明H2O2诱导HepG2细胞内产生大量ROS。经过蛋清肽预处理的HepG2细胞内ROS水平有不同程度的减少，且呈浓度依赖性。其中分子质量小于1kDa的蛋清肽和损伤组相比细胞内ROS水平显著降低（P＜0.05），尤其是分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解物，即使在低质量浓度（0.01mg/mL）下也能很好地抑制ROS对HepG2细胞的损伤，该组分的DCF荧光强度和对照组相比无显著差异，好于体外模拟胃肠消化产物活性。
6、UPLC-MS/MS鉴定蛋清肽的序列
如图6所示，解析分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解产物得到四肽FYCP、YCPI、YLPR。这3条多肽都是源于蛋清蛋白中含量最高的卵白蛋白，其中YLPR曾被Ayako等证明具有减缓小鼠焦虑的活性。
7、蛋清源活性肽的ABTS阳离子自由基清除能力
如图7所示，3条多肽的抗氧化活性都明显优于分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解产物，当多肽质量浓度达到5μg/mL时就能完全清除ABTS阳离子自由基，且FYCP和YCPI的抗氧化活性不相上下。这3条多肽中均含有Tyr和Pro，这类氨基酸的吲哚基和苯环可供氢，因此具有良好的ABTS阳离子自由基清除能力。
8、蛋清源活性肽的氧自由基吸收能力
图8显示了3种多肽和分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解物氧自由基吸收能力测定的荧光衰退曲线，可以看到FYCP的活性最强，ORAC为（2.42±0.13）μg/mL，其次是YCPI，ORAC为（2.04±0.19）μg/mL。这两条肽的抗氧化活性都要高于阳性对照Trolox，远远高于分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解物（（0.±0.）μg/mL）。但与ABTS阳离子自由基清除能力的结果不同，YLPR的氧自由基吸收能力（ORAC为（0.24±0.16）μg/mL）弱于分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶酶解物。这种差异可能是由于两种测定方法的作用机制不同，ORAC法是基于氢原子转移机制；ABTS阳离子自由基清除能力的测定是根据被氧化的ABTS变为蓝绿色的ABTS阳离子，当被测样品具有抗氧化活性时，颜色减褪。
结论
通过对比碱性蛋白酶及体外模拟胃肠消化处理后蛋清肽抗氧化活性差异，碱性蛋白酶酶解物的抗氧化活性最强，其次是体外模拟胃肠消化产物，未经处理的蛋清蛋白抗氧化活性十分微弱，这表明，对蛋清蛋白进行深加工可能有更高的生物活性和经济价值。此外，蛋清肽的抗氧化活性还与其分子质量和浓度密切相关，小分子质量高浓度的蛋清肽具有更强的抗氧化活性。其中分子质量小于1kDa的碱性蛋白酶解物能够有效抑制H2O2诱导的HepG2细胞内ROS的产生，进而阻止细胞的氧化应激损伤和凋亡。利用UPLC-MS/MS从该组蛋清源活性肽中解析出3条四肽FYCP、YCPI、YLPR，均具有良好的抗氧化活性。以上研究结果在一定程度上说明了蛋白质深加工的重要性，并为蛋清源生物活性肽的抗氧化活性研究提供了一定的参考。
本文《体外模拟胃肠消化及碱性蛋白酶处理后蛋清肽抗氧化活性差异及肽序列解析》来源于《食品科学》年41卷21期-页，作者：马思彤，刘静波，张婷，王莹，孙惠炎，魏以恒，王寒颖，雷洪辉，刘博群。DOI:10./spkx--20194-。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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