哈维氏弧菌（V.harvey）在石斑鱼中引起近70%的弧菌病，严重限制了石斑鱼的养殖。除了直接抑制病原体外，肠道微生物群在免疫稳态中起着关键作用，并为宿主提供必要的健康益处。然而，关于石斑鱼对V.harvey感染的免疫反应和肠道菌群的变化，目前仍知之甚少。为了了解龙胆石斑鱼中V.harvey的毒力机制，我们研究了不同毒力的V.harvey对龙胆石斑鱼的病理变化、免疫反应和肠道细菌群落的影响。心脏、肾脏和肝脏均有明显的组织病理学改变。尤其是在感染高毒力V.harvey后12小时，肝内出现结节，大量的V.harvey细胞定植于肝内。虽然在肠道中没有检测到V.harvey，但感染同时诱导了肠道-肝脏免疫反应。特别是，8个与细胞免疫过程相关的基因的表达，包括编码炎性细胞因子和受体的基因，以及模式识别蛋白，被V.harveyi感染显著诱导，尤其是高毒力V.harveyi株。V.harvey感染后肠道细菌群落也发生了显著变化，其中弧菌和发光菌数量增加，而缓生根瘤菌、乳酸菌、布氏杆菌和粪杆菌数量减少，差异率为82.01%。相应地，高毒力V.harvey感染增加了与细菌致病相关的四种细菌功能，而代谢和遗传信息处理功能则降低。这些发现表明，V.harvey定植于肝脏并诱导肠-肝免疫反应，该反应实质上破坏了鱼类肠道细菌群落的组成和种间相互作用，从而改变肠道微生物群介导的功能并诱导鱼类死亡。
本研究以珍珠龙胆石斑鱼为对象。研究了珍珠龙胆石斑鱼感染高、低毒力哈维氏弧菌后的组织病理学、免疫相关基因的表达及肠道微生物群落的结构和功能。这种设计使我们能够：（i）评估在石斑鱼疾病恶化期间，肠道细菌的种间相互作用和功能是如何改变的；（ii）筛选敏感的肠道类群，例如，与哈维氏弧菌感染进展密切相关的生物指示物；（iii）评估哈维氏弧菌感染、肠道微生物群和石斑鱼免疫反应之间的关系；以及（iv）为珍珠龙胆石斑鱼哈维氏弧菌病的免疫或微生物治疗提供科学依据。
实验分组：
哈维氏弧菌：含有氯霉素抗性质粒pMMB的pMMB源自哈维氏弧菌菌株，该菌株先前由本组从患病珍珠龙胆石斑鱼中分离。以氯霉素抗性作为病原菌负荷分析的筛选指标。V.harveyi:pMMB在珍珠龙胆中的半数致死剂量（LD50）为4.49×CFUg?1（数据未公布）。用两轮等位基因交换构建了一个hfq缺失突变体（数据未公布）。当向石斑鱼注射含有7.5LD50（最终剂量为3.37×CFUg?1）野生型菌株V.harveyi:pMMB的μL培养物时，注射后12小时（hpi）死亡率为41.11%，24小时死亡率为83.33%，48小时死亡率为86.70%，小时死亡率为86.70%，当石斑鱼注射相同量的hfq缺失突变株V.harveyiΔhfq:pMMB，hpi时的累积死亡率为0.00%（图S1）。因此，我们将这两株病毒分别定义为高毒力和低毒力哈维氏弧菌。在LB肉汤中培养，在28°C下添加2%额外的NaCl（LBS），其中含有34μgmL?1氯霉素（Cm）。
A组和B组分别腹腔注射μL高毒力和低毒力哈维氏弧菌（7.5LD50，最终剂量为3.37×CFUg?1），对照组腹腔注射μL生理盐水。注射后没有进食。
主要研究结果：
高、低毒力哈维氏弧菌感染石斑鱼的病原菌载量及组织病理学比较。
注射高毒力V.harveyi（图1A）后12hpi时肝脏出现结节，但注射低毒力V.harveyi或生理盐水后肝脏未出现结节（图1B-C）。病原菌载量分析表明，在12和24hpi条件下，高毒力哈V.harveyi对肝脏的平均病原菌载量分别是低毒力V.harveyi的3.77倍和1.67倍。两株V.harveyi的病原菌负荷都是先上升后下降，在24hpi时达到最高值。在生理盐水治疗的对照组中未检测到V.harveyi（图2）。
12hpi时，脑、脾、鳃或肠道未见明显的组织病理学改变（图S2A-C、G-I、J-L和图3G-I）。感染鱼的心脏有中度细菌性心肌炎，炎性细胞浸润的实质较少（图S2D，E）。感染的鱼的肾脏显示肾间质组织出血，与小管溶解有关（图S2M，N）。最严重的组织病理学改变见于肝脏。A组鱼的肝脏出现空泡变性和核流变碎片，并伴有胰腺上皮细胞的溶解（图3A-C）。B组肝脏存在静脉血管丢失和结缔组织坏死（图3D，E）。对照组心脏、肾脏或肝脏未发现组织病理学改变（图S2F、O和图3F），A组的组织病理损害较B组更严重（图S2和S3）。
图1.高毒力V.harveyi（A）、低毒力V.harveyi（B）和生理盐水处理鱼的病理学特征。
图2.高毒力V.harveyi（A组）、低毒力V.harveyi（B组）和生理盐水处理鱼（C组）的肝脏病原体负荷。
图3.龙胆石斑鱼感染V.harveyi后肝脏和肠道的组织病理学变化。
石斑鱼对高毒力和低毒力哈维氏弧菌的肠-肝免疫应答。
本研究选择了27个与9种不同免疫过程相关的免疫相关基因（表S1）来分析珍珠龙胆石斑鱼对不同毒力的V.harveyi株的肠肝免疫应答。肠道优势转录物（对照组肠道和肝脏的表达水平进行比较，两个对照组之间的平均表达改变超过8倍）编码半胱天冬酶（图4E）、C-C基序受体（CCR）（图S3H）、C-反应蛋白（CRR）（图S3O），和神经细胞粘附分子（NCAM）（图S3P），而肝脏优势转录物编码C1q（图4A）、转铁蛋白（图4F）、toll样受体（TLR）（图GL）和Kruppel样因子（图S3L）。
尽管大多数基因的表达没有显著改变，但注射V.harveyi后，大多数基因的平均表达变化很大（图4）。参与补体系统免疫过程的编码C1q的基因（图4A），三个编码干扰素诱导蛋白的基因（图4B-D），属于炎症细胞因子和受体的免疫过程，两个编码半胱天冬酶或转铁蛋白和受体的基因（图4E，F）属于与免疫细胞应答相关的其他基因的免疫过程，编码TLR、凝集素和核苷酸寡聚域（NOD）的3个基因（图4G-I），属于模式识别基因的免疫过程，编码铁蛋白的1个基因（图4J），属于急性期反应的免疫过程，而一个编码中性粒细胞胞浆因子（NCF）的基因（图4K）属于先天性免疫细胞的免疫过程，在注射高或低毒力V.harveyi株后，在肠道和肝脏中上调。注射高毒力V.harveyi株后，这些基因的表达往往高于低毒力V.harveyi株。
图4.感染高毒力V.harveyi（1，4）、低毒力V.harveyi（2，5）或经生理盐水处理的鱼（3，6）后，龙胆石斑鱼肠道（1，2，3）和肝脏（4，5，6）中11（A–K）的表达水平强烈改变了免疫相关基因。
鱼类肠道类群的分布
在拼接、质量控制和嵌合体过滤后，共获得个有效读数，每个样品的平均读数为64±（平均值±标准偏差）（表S2）。不同的测序深度被细化到每个样本个序列，结果在所有样本中有个操作分类单位（otu）。对OTUs进行了排列和注释，共有32个已知门，52个纲，目，科，属，种。最丰富的10个门类依次为变形菌、厚壁菌、拟杆菌等（图5A）。在属水平上，弧菌、发光菌、乳酸杆菌等的系统类型最为丰富，分别为变形菌属或厚壁菌属（图5B）。
图5.在各类群中平均有10个最丰富的门（A）和属（B）的相对丰度。
哈维病毒感染细菌多样性及成分的变化
细菌群落α多样性呈下降趋势：B组C组A组（表S2）。PERMANOVA表明，三组间群落组成差异有显著性。此外，低毒力影响组B的群落差异与高毒力影响组有显著差异，但与生理盐水处理对照组有显著差异。PCoA分析中的轴1（PCO1）将高毒力组A与低毒力组B和对照组C（确定为B/C组）分离（图6）。前两个轴（PCO1和PCO2）分别解释了组成变化的35.5%和18.5%（图6）。
根据PCoA结果，对最丰富的10个属进行简单分析，以比较A组和B/C组。结果表明，弧菌、发光菌、乳酸杆菌、布氏杆菌、缓生根瘤菌和粪杆菌占两组之间差异的80%以上（高达82.01%）（表1）。高毒力A组的弧菌和发光菌的丰度分别比B/C组高4.41倍和11.85倍，而缓生根瘤菌、乳酸杆菌、布氏杆菌和粪杆菌的丰度比B/C组低11.56-倍（表1）。
图6.哈维氏弧菌感染珍珠龙胆石斑鱼后肠道细菌群落组成差异性（Bray-Curtis距离）的PCoA分析。
表1.A组和B/C组细菌群落总数的差异用属水平的SIMPER分析确定（数据经平方根转换）。
哈维氏弧菌感染引起的功能预测和差异
总的来说，根据Tax4Fun的16SrRNA-OTU数据预测了条KEGG通路。3级最丰富的10条KEGG途径表明，肠道微生物群富含与转运蛋白、双组分系统、DNA修复和重组蛋白等相关的途径，属于环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢和细胞过程的范畴（图7A）。Pearson的相关分析确定了群落组成和功能之间的显著正相关（r=0.，P=0.；图7B）。
t试验表明，A组与B/C组间在KEGG3级的13种功能有显著差异，其中7个功能在高毒力组中诱导：生物膜形成霍乱弧菌、群体感应、细菌分泌系统等。在高毒力组A中，其他六条途径减少：碱基切除修复、核苷酸切除修复、核糖体等（图8）。
图7.KEGG3级10种最丰富功能的相对丰度。
图8.相对丰度1的细菌功能相对丰度在A组和B/C组之间差异显著。
肠道细菌群落内部和之间的相互作用、肠道内的预测功能以及免疫相关基因的表达
Pearson’s相关系数表明肠道细菌群落内部和之间的复杂相互关系、肠道中的预测功能以及免疫相关基因的表达（表S3）。弧菌与乳酸菌（r=-0.，P=0.02）、布氏杆菌（r=-0.，P=0.05）或粪杆菌（r=-0.，P=0.）呈显著负相关，乳酸菌与粪杆菌呈显著正相关（r=0.，P=0.）。6个指示类群中的4个（弧菌、乳酸杆菌、Blautia和粪便）与13个显著改变的功能密切相关。增加的类群和诱导功能之间以及减少的类群和减少的功能之间往往呈正相关，但增加的分类群和减少的功能之间以及减少的分类群和诱导功能之间呈负相关（表S3）。
发光细菌的丰度与两种干扰素诱导蛋白（r=0.和0.，P=0.和0.）和一种半胱天冬酶（r=0.，P=0.）的表达水平显著正相关。此外，在不同的预测功能之间以及各种免疫相关基因之间综合检测到了强关联（表S3）。
小结：
本研究证明哈维氏弧菌感染可引起珍珠龙胆石斑鱼的病理改变。虽然在肠道中没有检测到哈维氏弧菌，但肠-肝轴在肝脏和肠道中引起平行的免疫反应。这反过来严重破坏了石斑鱼肠道细菌群落的组成和功能，影响了石斑鱼的生存。六种对感染敏感的肠道分类群是哈维氏弧菌感染的潜在指标。这些发现从微生物生态学的角度显著提高了我们对肠道微生物群与宿主免疫反应之间相互作用的理解，同时从宿主反应的角度阐明了珍珠龙胆石斑鱼中哈维氏弧菌的毒力机制。在未来的工作中，我们将致力于以下两个目标：（i）验证模拟复杂“野生”生态系统的自然感染过程中的生态模式；（ii）鉴定在高毒力哈维氏弧菌感染组中减少的四种益生菌类群的功能，以建立以微生物为基础的治疗珍珠龙胆石斑鱼哈维氏弧菌病的方法。
南湖意