结直肠癌是发病率和死亡率位于前列的消化系统恶性肿瘤[1]。化疗是结直肠癌治疗的重要手段，特别是对于晚期结直肠癌患者，化疗能够抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积和抑制肿瘤转移。以氟尿嘧啶和卡培他滨为代表的细胞毒性药物，能够抑制胸苷合成酶的活性，从而抑制DNA复制[2]。奥沙利铂是另外一种常用于治疗结直肠癌的细胞毒性药物。奥沙利铂通过与DNA分子共价结合，形成DNA加合物，抑制肿瘤细胞增殖和诱导G2期阻滞[3]。在结直肠癌治疗中，上述两种药物的联合治疗已经广泛应用。虽然多数患者初始对于奥沙利铂和氟尿嘧啶的反应良好，但是仍然有部分患者最终出现复发。有研究显示，复发的结直肠癌患者5年生存率不足10%[4]。所以，探索结直肠癌患者复发的分子标志物具有重要的临床意义。
肿瘤的复发涉及肿瘤细胞与微环境之间复杂的相互作用。近些年来肠道微生物的研究逐步开展，发现了肠道菌群与结直肠癌的发生与发展密切相关。肠道菌群可以通过影响肠道内的炎症水平和肿瘤细胞生长相关的信号通路，发挥促进肿瘤生长的功能[5-8]。一项利用小鼠模型的研究显示，肠道菌群能够影响肠道黏膜内的免疫状态，从而影响化疗和免疫治疗的效果[9-10]。人类消化道中的菌群也与炎性细胞因子的产生有关[11]。粪肠球菌是一种消化道常见的革兰氏阳性球菌。目前，已经有文献报道，粪肠球菌丰度在结直肠癌中显著高于结直肠息肉患者和健康人群[12]。粪肠球菌能够促进结直肠肿瘤细胞系的增殖[13]，而且可以通过葡萄糖醛酸磷酸转移酶系统加快结肠炎的发展[14]。粪肠球菌感染可能与慢性胰腺炎及肿瘤的发生有一定的关系[15]。由此可见，粪肠球菌在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用。但是，目前粪肠球菌与肿瘤复发之间的关系尚未见报道。
在本研究中，我们通过选取哈尔滨医院普外科结直肠癌复发患者与非复发患者的粪便样本。通过16s测序技术，探索肠道菌群与结直肠肿瘤复发的关系。阐述粪肠球菌对结直肠癌复发的临床意义。
资料与方法
一、临床样本的选择
本研究所有的患者及样本均来自于哈尔滨医院普外科。自年1月至年12月，共例患者经病理诊断为结直肠癌，术前通过胸部及全腹CT排除远处脏器转移。同时收集患者的临床信息及粪便样本。所有患者均接受手术治疗，外科手术后，患者接受标准的XELOX方案化疗，根据RECIST标准诊断共有复发患者39例，非复发患者64例[18]。匹配年龄、性别及肿瘤分期等临床指标后，选择10对复发与非复发患者用于16sRNA测序，其余29例复发患者及54例非复发患者用于PCR验证。本研究方案经过哈尔滨医院伦理委员会批准，手术前患者均签署了知情同意书。使用胸部及全腹增强CT及肠镜检测患者术后复发情况，并进行电话随访，随访间隔为3个月，连续随访3年。
二、16s高通量测序
共收集份粪便样本，DNase酶处理后，经过RNeasyMini柱分离纯化获得高纯度RNA。分离的RNA样本使用安捷伦Bioanalyzer进行质量控制。RNA样本在IlluminaHiseq平台进行bp的双端测序。RNA测序数据使用TopHat-HTSeq-DeSeq2软件处理[16]。测序读数数据使用TopHatv2.0.11软件比对（humangenome，hg19）[17]。根据Ensembl_GRCh37数据库默认值建立基因名称索引。通过HTSeq包和GTF注释文件，将测序数据文件转化为读数文件。将每个样本的读数文件整理为表达矩阵，用于后续差异表达的筛选。使用DESeq2包筛选差异表达基因，其中读数小于5的基因认为无表达，不予以分析。
三、粪肠球菌检测
根据既往研究的报道，合成检测粪肠球菌所需要的引物。新鲜粪便样本中的基因组DNA通过QIAampDNAMini试剂盒提取。每个样本的基因组DNA用于PCR检测粪肠球菌表达量的检测。反应体系配制如下：40ng的gDNA，10μL的1×PowerSYBRGreenPCR混合液，0.4μM的正向与反向引物置于96孔板中。通过Real-TimePCRSystem扩增检测粪肠球菌的表达。扩增条件如下：95℃10分钟；95℃15秒钟，反复40循环；60℃持续1分钟。粪肠球菌的表达量用Ct值表示。
结果
一、粪便粪肠球菌与结直肠肿瘤患者的复发相关
本研究对10对结直肠肿瘤复发患者和非复发患者粪便样本进行16s测序分析。根据测序数据结果进行主成分分析（principle