背景与目的：膳食脂肪摄入和结直肠癌风险增加息息相关。我们研究了高脂肪饮食(HFD)通过调节肠道微生物群和代谢物驱动结直肠癌的发生。
方法：在偶氮甲烷（AOM）和Apcmin/+结直肠癌模型的小鼠中，将高脂肪饮食（HFD）或对照饮食(CD)饲喂给同窝小鼠，同时使用或者不使用抗生素鸡尾酒治疗。然后使用粪便菌群移植的无菌小鼠进行验证并通过宏基因组测序和高效液相色谱-质谱分别检测肠道微生物群和代谢物。最后通过脂多糖(LPS)水平和透射电镜测定肠道屏障功能。
结果：与CD喂养的小鼠相比，喂食HFD会促进AOM小鼠和Apcmin/+小鼠结肠直肠肿瘤的发生。在HFD喂养的小鼠中，通过抗生素减少肠道微生物群可减轻结肠肿瘤的形成。HFD喂养的小鼠的肠道微生物群组成发生显著变化，其中病原菌Alistipessp.Marseille-P和Alistipessp.5CPEGH6增加，益生菌Parabacteroidesdistasonis（狄氏副拟杆菌）减少，并且小鼠肠道屏障功能受损。此外，在AOM处理的无菌小鼠中，HFD能够调节肠道微生物群促进结肠直肠肿瘤发生，表明肠道微生物群在HFD相关的结肠直肠肿瘤发生中是至关重要的。在HFD喂养的小鼠中也观察到肠道代谢物改变，包括溶血磷脂酸（LPA）升高，其被证实促进CRC细胞增殖并损害细胞连接。此外，在没有干扰的情况下，将来自HFD喂养的小鼠的粪便转移至无菌小鼠导致结肠细胞增殖增加，损害了肠屏障功能并诱导了致癌基因表达。结论：HFD通过诱导小鼠肠道微生物失调、LPA升高的代谢紊乱和肠道屏障功能障碍来促进结直肠癌的发生。
论文ID
原名：High-FatDietPromotesColorectalTumorigenesisthroughModulatingGutMicrobiotaandMetabolites
译名：高脂肪饮食通过调节肠道微生物群和代谢物促进结直肠癌发生
期刊：Gastroenterology
IF：22.
发表时间：.8.27
通讯作者：于君
通讯作者单位：香港中文大学
DOI号：10./j.gastro..08.
实验设计
结果
1在AOM和Apcmin/+小鼠模型中HFD依靠肠道微生物群促进CRC的发展为了研究HFD在结直肠肿瘤发生中的作用，我们用HFD或CD喂养经AOM处理的常规雄性C57BL/6小鼠，同时进行或不进行定期抗生素鸡尾酒治疗(图1A)。在取样前进行小鼠结肠镜检查，饲喂HFD的小鼠出现肉眼可见的肿瘤，但饲喂CD或用抗生素治疗的HFD喂养的小鼠没有观察到明显的肿瘤(图1B)。取样时，饲喂HFD的小鼠的体重和脂肪量均高于饲喂CD的小鼠(P0.)，然而服用抗生素引起肠道微生物群减少的HFD喂养的小鼠，其体重和脂肪量没有影响(图1C)。饲喂HFD的小鼠的结直肠癌数量和体积也明显大于饲喂CD的小鼠(均为P0.05；图1D)。结肠切片的组织学检查(图1E)证实，与饲喂CD的小鼠相比，饲喂HFD的小鼠发生腺癌、高度和低度异长增生的比例更高(P0.05；图1E)。饲喂HFD的小鼠结肠切片显示Ki-67阳性细胞明显增多，表明HFD喂养的小鼠细胞增殖增加(P0.01；图1F)。然而，饲喂HFD的小鼠肠道微生物群被抗生素消耗后，结肠癌的数量和体积都显著减少(均为P0.01；图1D)，但饲喂CD的小鼠没有显著减少(附图1)。结肠切片的组织学检查(图1E)证实，服用抗生素的HFD组小鼠的腺癌、高度和低度异常增生的比例低于未服用抗生素的HFD组(P0.01；图1E)，同时Ki-67阳性细胞显著减少(P0.05；图1F)。
图1.在AOM模型中，HFD依赖肠道微生物群促进结直肠癌的发展。(A)AOM诱导的CRC小鼠模型饮食和抗生素治疗的实验设计。(B)第20周结直肠镜监测的代表性图像。(C)CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HED喂养小鼠处死前的体重和脂肪量。(D)CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养小鼠处死前的结直肠肿瘤数量和肿瘤体积的代表性图像。(E)HE染色对小鼠结直肠的病理诊断。病理评分按以下标准定量分析:正常0分;1为LGD;2为HGD，3为癌症。(F)小鼠结直肠免疫组化染色，定量分析Ki-67指数。AOM,偶氮甲烷;CRC,结直肠癌;CD,控制饮食;HFD,高脂肪饮食;Abx,抗生素;HE，苏木精和伊红;LGD,低度发育不良;HGD,高度发育不良;IHC,免疫化学。为了验证这些发现，我们设置了转基因Apcmin/+小鼠模型（图2A）。与AOM诱导的结直肠肿瘤小鼠模型中的结果一致，HFD显著增加Apcmin/+小鼠的体重和脂肪量（均为P0.05），并且抗生素治疗后HFD喂养对小鼠的体重和脂肪量没有影响（图2B）。HFD喂养的Apcmin/+小鼠结直肠肿瘤数目显著高于CD喂养的Apcmin/+小鼠（P＜0.05；图2C），也表现出肿瘤体积增大的趋势（P＝0.07；图2C）。此外，服用抗生素减少肠道微生物群显著降低了HFD喂养的Apcmin/+小鼠的肿瘤数量（P0.01）和体积（P0.01；图2C），但在CD喂养的Apcmin/+小鼠中没有（补充图2A和2B）。此外，在HFD喂养的Apcmin/+小鼠的小肠中也观察到肿瘤体积增大，而抗生素诱导肠道微生物群减少显著降低肿瘤体积（补充图2C）。结肠切片的组织学检查（图2D）证实，与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠发生更大比例的腺癌和高度异常增生（P＜0.01；图2D）。HFD喂养的Apcmin/+小鼠与CD喂养的Apcmin/+小鼠相比，Ki-67阳性细胞明显增多（P＜0.05；图2E）。而抗生素治疗的HFD喂养的Apcmin/+小鼠显示腺癌、高度和低度异常增生的比例降低（P＜0.01；图2D）与无抗生素处理的HFD喂养小鼠相比，病理性Ki-67阳性细胞显著减少（P＜0.05；图2E）。这些发现一致表明HFD促进结肠直肠肿瘤发生，并且肠道微生物群可能在介导HFD相关的CRC发展中起重要作用。
图2.在Apcmin/+小鼠模型中，HFD依赖于肠道微生物群促进CRC发展。(A)Apcmin/+小鼠模型饮食和抗生素治疗的实验设计。(B)第20周结肠镜检查的典型图像。(C）CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养的Apcmin/+小鼠在处死前的体重和脂肪量。(D)CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养小鼠处死前的结直肠肿瘤数量和肿瘤体积的代表性图像。(E)HE染色对小鼠结直肠的病理诊断。病理评分按以下标准定量分析:正常0分;1为LGD;2为HGD;3为癌症。(F)小鼠结直肠免疫组化染色，定量分析Ki-67指数。AOM，偶氮甲烷;CRC，结直肠癌；CD，控制饮食；HFD，高脂肪饮食；Abx，抗生素；HE，苏木精和伊红;LGD,低度发育不良;HGD，高度发育不良;IHC,免疫化学。
2HFD引起的肠道微生物群失调促进CRC的发生为了探索肠道微生物失调在HFD相关CRC发展中的潜在作用，我们在AOM模型中对来自CD喂养，HFD喂养和抗生素治疗的HFD喂养小鼠的粪便样品进行了鸟枪宏基因组测序。通过主成分分析（PCA）对CD喂养，HFD喂养和抗生素治疗的HFD喂养的小鼠的微生物群组成进行鉴定（图3A）。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠中细菌多样性降低以及细菌丰富度降低（图3A）。在HFD喂养的小鼠中有几种细菌类群存在差异（图3B）。HFD喂养的小鼠中潜在致病细菌种类（包括Alistipessp.Marseille-P和Alistipessp.5CPEGH6）的丰度显著高于CD喂养的小鼠（均为P0.01；图3C）；同时，两种保护性细菌，Parabacteroidesdistasonis（狄氏副拟杆菌，P.distasonis）和Parabacteroidessp.CT06在HFD喂养的小鼠中显著减少（均为P0.01；图3C）。通过定量PCR验证了与CD喂养的Apcmin/+小鼠相比，在HFD喂养的Apcmin/+小鼠中Alistipessp.Marseille-P和P.distasonis的差异丰度发生典型失调（补充图3）。另外的共培养实验表明P.distasonis抑制细胞生长，Alistipessp.促进CRC细胞系（Caco-2和HCT）的细胞生长（图3D），表明HFD诱导的肠道微生物组成的变化可能至少部分有助于CRC的发展。
3HFD诱发的肠道微生物群失调损害了肠道屏障功能为了验证肠屏障功能是否在HFD相关的结直肠肿瘤发生中起作用，我们通过测定血清LPS水平来检测HFD对小鼠结肠细胞旁通透性的影响。与用AOM处理的CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠血清LPS浓度升高(P0.05；图3E)。与此一致，透射电镜下的肠道屏障结构证实了HFD喂养的小鼠结肠细胞间连接的异常，包括顶端连接复合体和细胞旁间隙的间隙扩大，表明屏障功能受损(图3F)。此外，HFD喂养的小鼠紧密连接蛋白E-cadherin(一种细胞粘附分子)和Claudin-3(紧密连接的关键成分，作为肠道屏障完整性的标志)的表达显著减少(均为P0.01；图3G)。E-cadherin和Claudin-3蛋白的分布主要定位于CD喂养小鼠的结肠上皮细胞膜上，但在HFD喂养的小鼠中它们的表达被分解(均为P0.01；图3H)。而服用抗生素的HFD小鼠，其肠道屏障结构得到改善(图3F)，E-cadherin和Claudin-3的蛋白表达恢复(E-cadherin,P0.01；Claudin-3，P0.05)(图3G)，E-cadherin和Claudin-3的分布和密度增加(E-cadherin,P0.01；Claudin-3，P0.05)(图3H)。综上所述，这些结果表明HFD至少部分是通过引起肠道微生物失调而导致结肠屏障功能受损的。
图3.HFD诱导肠道微生物群失调和肠道屏障功能障碍。(A)AOM治疗的CD喂养、HFD喂养和Abx治疗的HFD喂养的小鼠的无监督主成分分析、Shannon多样性和肠道微生物群的物种丰富度。(B)CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养小鼠肠道微生物组的热图。(C)与用AOM治疗的CD喂养或Abx治疗的HFD喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠中的Alistipessp.Marseille-P，Alistipessp.5CPEGH6，P.distasonis和Parabacteroidessp.CT06的丰度。(D)Caco-2和HCTCRC细胞与P.distasonis、Alistipessp、大肠杆菌和空白对照共培养的生长曲线。(E)AOM模型中CD喂养和HFD喂养小鼠血清中的LPS浓度。(F)通过TEM显示CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养小鼠的细胞间连接的代表性图像。(G)通过蛋白质印迹和定量分析，肠道屏障相关蛋白E-cadherin和Claudin-3在CD喂养、HFD喂养和Abx处理的HFD喂养小鼠的结直肠组织中的表达水平。(H)免疫组化定量分析CD喂养、HFD喂养和Abx喂食HFD喂养小鼠结直肠组织中粘附分子E-cadherin和Claudin-3的分布*P0.05，**P0.01，***P0.。CD，控制饮食；HFD，高脂肪饮食；Abx，抗生素；TEM，透射电子显微镜；IHC，免疫化学。
4HFD调节的肠道微生物群促进AOM处理的无菌小鼠结直肠肿瘤的发生为了进一步验证HFD调节的微生物群对结直肠肿瘤发生的影响，我们将HFD喂养的小鼠的粪便样本转移到用AOM处理的无菌小鼠(图4A)。粪便微生物群移植没有改变AOM处理的无菌小鼠的体重和脂肪量(补充图4A)。用HFD喂养的小鼠的粪便样品灌胃的无菌小鼠与灌胃PBS的AOM处理的无菌小鼠相比(图4B)，另枝菌属显著富集(P0.，补充图4B)，结直肠肿瘤的数量增多(P0.01)以及肿瘤的体积增大(P0.05)。结直肠肿瘤经组织学证实为低度异常增生(图4C)。与此相一致的是，AOM处理的HFD喂养的小鼠（HFD-FMT-AOM）结肠组织中Ki-67阳性细胞较对照组AOM处理的小鼠明显增多(P0.05；图4D)。此外，与对照组小鼠相比，灌胃HFD小鼠粪便标本的小鼠结直肠组织中E-cadherin和Claudin-3的表达明显减少(E-cadherin和Claudin-3分别为P0.05和P0.01；图4E)。同样，E-cadherin和Claudin-3蛋白在HFD-FMT-AOM小鼠中被分解，但在对照AOM小鼠的结肠上皮细胞膜上易表达(E-cadherin和Claudin-3分别为P0.01和P0.05；图4F)。综上所述，这些结果表明，HFD调节的肠道微生物群通过损害肠道屏障功能促进了结直肠肿瘤的发生。
图4.在AOM处理的无菌小鼠中HFD调节的肠道微生物群促进结直肠肿瘤发生。(A)HFD喂养AOM处理的无菌小鼠进行HFD相关粪便微生物群移植的实验设计。(B)处死前结直肠的代表性图像。Control-AOM和HFD-FMT-AOM小鼠的肿瘤数量和肿瘤体积。(C)HE染色(D)Ki-67IHC染色以及Control-AOM和HFD-FMT-AOM无菌小鼠结肠切片Ki-67指数的定量分析。(E)通过蛋白质印迹和定量分析，Control-AOM和HFD-FMT-AOM小鼠结直肠组织中肠道屏障相关蛋白E-cadherin和Claudin-3的表达水平。(F)IHC用于在Control-AOM和HFD-FMT-AOM小鼠的结肠组织中定量分析粘附分子E-cadherin和Claudin-3的分布。HFD，高脂肪饮食；AOM，氧化偶氮甲烷；FMT，粪便微生物组移植；HE，苏木精和伊红；IHC，免疫化学。5HFD通过改变肠道代谢物促进结直肠肿瘤的发生为了揭示由HFD诱发的代谢变化，我们对用AOM处理的CD喂养的小鼠，HFD喂养的小鼠和抗生素治疗的HFD喂养的小鼠的粪便样品进行代谢谱分析。根据无监督PCA分析和PLS判别监督分析（PLS-DA），发现膳食脂肪摄入和抗生素治疗的肠道代谢物显著不同（图5A）。与CD喂养的小鼠相比，在HFD喂养的小鼠中鉴定出差异的代谢物（图5B，补充表4）。其中，包括溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酸（LPA）（LPC的下游代谢物）在内的甘油磷脂都是HFD喂养小鼠中上调最多的异常代谢物（图5B，补充图5）。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠中上调的代谢物富含不同的代谢组学信号传导途径。在这些途径中，甘油磷脂代谢是喂养HFD的小鼠中改变的主要途径（图5C）。另一方面，与HFD喂养的小鼠相比，抗生素治疗的HFD喂养小鼠中肠道微生物群的减少显著恢复了已改变的代谢物（图5D，补充表5），LPA和LPC水平降低（图5D，补充图5）。同样地，肠道微生物群的消耗减少了包括甘油磷脂代谢在内的途径（图5E）。
我们通过综合分析确定了HFD喂养的小鼠肠道微生物变化和代谢产物之间的潜在联系。发现Alistipessp.Marseille-P,Alistipessp.5CPEGH6,Bifidobacteriumanimalis（动物双岐杆菌）以及Alistipesshahii的富集与LPA、LPC均呈正相关(图5F)。而Parabacteroidessp.CT06和P.distasonis与LPA和LPC均呈负相关(图5F)。这些结果表明，肠道微生物群及其相关的代谢物的改变都有助于HFD相关的结直肠肿瘤的发生。
图5.HFD引起的小鼠粪便代谢特征的改变。(A1)PCA图和(A2)PLS_DA图用于CD、HFD和Abx处理的HFD小鼠肠道代谢组学分析。(B)比较饲喂HFD和CD的小鼠的差异代谢物的火山图。(C)HFD喂养的小鼠与CD喂养的小鼠相比，差异富集代谢物的通路分析。(D)比较HFD喂养并接受抗生素治疗或不接受抗生素治疗的小鼠之间的差异代谢物的火山图。(E)Abx处理的HFD小鼠与HFD喂养的小鼠的不同代谢物的通路分析。(F)HFD改变的微生物和代谢物之间的相关性分析。PCA，主成分分析；PLS_DA，偏最小二乘判别分析；CD，对照饮食；HFD，高脂饮食；Abx，抗生素；LPA，溶血磷脂酸；LPC，溶血磷脂酰胆碱。6HFD改变的代谢物促进细胞增殖和细胞连接障碍用差异和非差异代谢物处理两种CRC细胞系（Caco-2和HCT）和一种正常结直肠上皮细胞系（NCM）去探索HFD改变的代谢物在CRC发展中的潜在作用。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠中的去甲二氢愈创木酸（NDGA）和神经酸显著减少（补充图6A）。肌苷是HFD喂养的小鼠和CD喂养的小鼠之间的非差异代谢物之一，用作阴性对照。共培养实验表明，NDGA通过抑制细胞生长，显著抑制CRC细胞系Caco-2和HCT的细胞增殖，但不抑制正常上皮细胞系NCM的细胞增殖（均为P＜0.01；图6A）和集落形成（均为P＜0.01；图6B）。同样，神经酸也抑制Caco-2和HCT细胞生长（均为P＜0.01；补充图6B）和集落形成（均为P＜0.05）（补充图6C）。此外，我们分别用NDGA和神经酸处理患者来源的CRC类器官，发现NDGA和神经酸均可显著抑制CRC类器官生长（均为P0.01，补充图6D）。然后，我们